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                            凱式定氮儀

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                                凱氏定氮儀是根據蛋白質中氮的含量恒定的原理,通過測定樣品中氮的含量從而計算蛋白質含量的儀器。因其蛋白質含量測量計算的方法叫做凱氏定氮法,故被稱為凱氏定氮儀,又名定氮儀、蛋白質測定儀、粗蛋白測定儀。這種方法是由凱耶達爾在1883年發明的。

                            簡介

                                  凱氏定氮儀是根據蛋白質中氮的含量恒定的原理,通過測定樣品中氮的含量從而計算蛋白質含量的儀器。因其蛋白質含量測量計算的方法叫做凱氏定氮法,故被稱為凱氏定氮儀,又名定氮儀、蛋白質測定儀、粗蛋白測定儀。這種方法是由凱耶達爾在1883年發明的。

                            原理

                                  將有機化合物與硫酸共熱使其中的氮轉化為硫酸銨。在這一步中,經常會向混合物中加入硫酸鉀來提高中間產物的沸點。樣本的分析過程的終點很好判斷,因為這時混合物會變得無色且透明(開始時很暗)在得到的溶液中加入少量氫氧化鈉,然后蒸餾。這一步會將銨鹽轉化成氨。而總氨量(由樣本的含氮量直接決定)會由反滴定法確定:冷凝管的末端會浸在硼酸溶液中。氨會和酸反應,而過量的酸則會在甲基橙的指示下用碳酸鈉。滴定所得的結果乘以特定的轉換因子就可以得到結果。

                            功能參數

                              1、測定范圍:0.1mgN ~240mgN;
                              2、測定樣品量:固體≤ 5g/個,液體≤ 15ml/個;
                              3、回收率:≥99.5%;
                              4、重復性:≤ ±1%;
                              5、蒸餾速度:4 ~8分鐘/樣品;
                              6、程序自動控制:加堿、加硼酸、稀釋和蒸餾;
                              7、冷卻水消耗:2L/分鐘;
                              8、電源:220V 50Hz;
                              9、功率:1200W;
                              10、外形尺寸:380*330*820
                              11、重量:24kg。

                            使用方法

                              凱氏定氮儀操作步驟:
                              (一)消化
                                     1、準備6個凱氏燒瓶,標號。1、2、3號燒瓶中分別加入適當濃度的蛋白溶液1.0mL,樣品要加到燒瓶底部,切勿沾在瓶口及瓶頸上。再依次加入硫酸鉀-硫酸銅接觸劑0.3g,濃硫酸2.0mL,30%過氧化氫1.0mL。4、5、6號燒瓶作為空白對照,用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質,對樣品測定進行校正。4、5、6號燒瓶中加入蒸餾水1.0mL代替樣液,其余所加試劑與1、2、3號燒瓶相同。
                                     2、將加好試劑的各燒瓶放置消化架上,接好抽氣裝置。先用微火加熱煮沸,此時燒瓶內物質炭化變黑,并產生大量泡沫,務必注意防止氣泡沖出管口。待泡沫消失停止產生后,加大火力,保持瓶內液體微沸,至溶液澄清后,再繼續加熱使消化液微沸15min。在消化過程中要隨時轉動燒瓶,以使內壁粘著物質均能流入底部,以保證樣品完全消化。消化時放出的氣體內含SO2,具有強烈刺激性,因此自始自終應打開抽水泵將氣體抽入自來水排出。整個消化過程均應在通風櫥中進行。消化完全后,關閉火焰,使燒瓶冷卻至室溫。
                              (二)蒸餾和吸收
                                     蒸餾和吸收是在微量凱氏定氮儀內進行的。凱氏定氮蒸餾裝置種類甚多,大體上都由蒸氣發生、氨的蒸餾和氨的吸收三部分組成。
                              1、儀器的洗滌
                                    儀器安裝前,各部件需經一般方法洗滌干凈,所用橡皮管、塞須浸在10%NaOH溶液中,煮約10min,水洗、水煮10min,再水洗數次,然后安裝并固定在一只鐵架臺上。
                                     儀器使用前,微量全部管道都須經水蒸氣洗滌,以除去管道內可能殘留的氨,正在使用的儀器,每次測樣前,蒸氣洗滌5min即可。較長時間未使用的儀器,重復蒸氣洗滌,不得少于三次,并檢查儀器是否正常。仔細檢查各個連接處,保證不漏氣。
                                     首先在蒸氣發生器中加約2/3體積蒸餾水,加入數滴硫酸使其保持酸性,以避免水中的氨被蒸出而影響結果,并放入少許沸石(或毛細管等),以防爆沸。沿小玻杯壁加入蒸餾水約20mL讓水經插管流入反應室,但玻杯內的水不要放光,塞上棒狀玻塞,保持水封,防止漏氣。蒸氣發生后,立即關閉廢液排放管上的開關,使蒸氣只能進入反應室,導致反應室內的水迅速沸騰,蒸出蒸氣由反應室上端口通過定氮球進入冷凝管冷卻,在冷凝管下端放置一個錐形瓶接收冷凝水。從定氮球發燙開始計時,連續蒸煮5min,然后移開煤氣燈。沖洗完畢,夾緊蒸氣發生器與收集器之間的連接橡膠管,由于氣體冷卻壓力降低,反應室內廢液自動抽到反應室外殼中,打開廢液排出口夾子放出廢液。如此清洗2~3次,再在冷凝管下換放一個盛有硼酸-指示劑混合液的錐形瓶使冷凝管下口完全浸沒在溶液中,蒸餾1~2min,觀察錐形瓶內的溶液是否變色。如不變色,表示蒸餾裝置內部已洗干凈。移去錐形瓶,再蒸餾1~2min,用蒸餾水沖洗冷凝器下口,關閉煤氣燈,儀器即可供測樣品使用。
                              2、無機氮標準樣品的蒸餾吸收
                                     由于定氮操作繁瑣,為了熟悉蒸餾和滴定的操作技術,初學者宜先用無機氮標準樣品進行反復練習,再進行有機氮未知樣品的測定。常用巳知濃度的標準硫酸銨測試三次。
                                     取潔凈的100mL錐形瓶五只,依次加入2%硼酸溶液20mL,次甲基藍-甲基紅混合指示劑(呈紫紅色)3~4滴,蓋好瓶口待用。取其中一只錐形瓶承接在冷凝管下端,并使冷凝管的出口浸沒在溶液中。注意:在此操作之前必須先打開收集器活塞,以免錐形瓶內液體倒吸。準確吸取2mL硫酸銨標準液加到玻杯中,小心提起棒狀玻塞使硫酸銨溶液慢慢流入蒸餾瓶中,用少量蒸餾水沖洗小玻杯3次,一并放人蒸餾瓶中。然后用量筒向小玻杯中加入10mL30%NaOH溶液,使堿液慢慢流入蒸餾瓶中,在堿液尚未完全流入時,將棒狀玻塞蓋緊。向小玻杯中加約5mL蒸餾水,再慢慢打開玻塞,使一半水流入蒸餾瓶,一半留在小玻杯中作水封。關閉收集器活塞,加熱蒸氣發生器,進行蒸餾。錐形瓶中的硼酸-指示劑混合液由于吸收了氨,由紫紅色變成綠色。自變色時起,再蒸餾3~5min,移動錐形瓶使瓶內液面離開冷凝管下口約lcm,并用少量蒸餾水沖洗冷凝管下口,再繼續蒸餾1min,移開錐形瓶,蓋好,準備滴定。
                                     在一次蒸餾完畢后,移去煤氣燈,夾緊蒸氣發生器與收集器間的橡膠管,排除反應完畢的廢液,用水沖洗小玻杯幾次,并將廢液排除。如此反復沖洗干凈后,即可進行下一個樣品的蒸餾。按以上方法用標準硫酸銨再做兩次。另取2mL蒸餾水代替標準硫酸銨進行空白測定二次。將各次蒸餾的錐形瓶一起滴定。
                              3、未知樣品及空白的蒸餾吸收
                                      將消化好的蛋白樣品三支,空白對照液三支,依次作蒸餾吸收。
                              加5mL熱的蒸餾水至消化好的樣品或空白對照液中,通過小玻杯加到反應室中,再用熱蒸餾水洗滌小玻杯3次,每次用水量約3mL,洗滌液一并倒入反應室內。其余操作按標準硫酸銨的蒸餾進行。
                                     由于消化液內硫酸鉀濃度高而呈粘稠狀,不易從凱氏燒瓶內倒出,必須加入熱蒸餾水5mL稀釋之,如果有結晶析出,必須微熱溶解,趁熱加入玻杯,使其流入反應室。此外,還應當注意趁儀器洗滌尚未完全冷卻時立即加入樣品或空白對照液,否則消化液通過冷卻的管道容易析出結晶,造成堵塞。

                              (三)凱氏定氮儀滴定
                                      樣品和空白蒸餾完畢后,一起進行滴定。
                                     打開接受瓶蓋,用酸式微量滴定管以0.0100mol/L的標準鹽酸溶液進行滴定。待滴至瓶內溶液呈暗灰色時,用蒸餾水將錐形瓶內壁四周淋洗一次。若振搖后復現綠色,應再小心滴入標準鹽酸溶液半滴,振搖觀察瓶內溶液顏色變化,暗灰色在一二分鐘內不變,當視為到達滴定終點。若呈粉紅色,表明已超越滴定終點,可在已滴定耗用的標準鹽酸溶液用量中減去0.02mL,每組樣品的定氮終點顏色必須完全一致。空白對照液接受瓶內的溶液顏色不變或略有變化尚未出現綠色,可以不滴定。記錄每次滴定耗用標準鹽酸溶液毫升數,供計算用。

                            其他信息

                                  凱氏定氮法的普遍適用性、精確性和可重復性已經得到了國際的廣泛認可。它已經被確定為檢測食品中蛋白質含量的標準方法。但是,這種方法并不能給出真實的蛋白質含量,因為所測定的氮可能不僅僅是由蛋白質轉化來的。這可以從2007年美國寵物食品污染事件和2008年中國毒奶粉事件等食品安全事件中被體現:三聚氰胺,一種含氮量較高的物質,被添加到了食品中以偽造較高的含氮量。另外,由于不同的氨基酸序列,這種方法也需要許多不同的校正因子。而且,凱氏定氮法還需要使用濃硫酸和較長時間的加熱(一般來講,大于1小時)。這也造成了在粗略測量蛋白質含量時,杜馬斯法有時更方便些。


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